جداسازی و تایپینگ مولکولی باکتری ،در مرغان گوشتی مبتلا به انتریت نکروتیک و سالم در مرغداری های شهرستان سبزوار

1.امتیاز دهی به لاشه های مبتلا به انتریت نکروتیک: موارد درگیر بر اساس علایم کالبدگشایی موجود در روده بویژه ژژنوم شناسایی شده و با توجه به شدت جراحات امتیاز دهی میشود 2-جمع آوری تاریخچه کامل گله،توسط پرسشنامه. 3-جداسازی،کشت و تایپینگ: 1-جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس ازروده مرغ های تلف شده و یا درگیر با فرم حاد بیماری آنتریت نکروتیک که در این طرح شامل ده نمونه در طول یک سال میشود . 2- جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس ازروده مرغ های سالم و یا تلف شده بر اثرعواملی غیر از آنتریت که در این طرح شامل ده نمونه در طول یک سال میشود . 3- شناسایی حضور و یا عدم حضور ژن های توکسین cpa، cpb، etx وia ژن های مربوط به 4 توکسین اصلی آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا که در تایپینگ مولکولی ایزوله های کلستریدیوم پرفرنجنس به کار گرفته میشوند و همچنین حضور و یا عدم حضور دو ژن توکسین cpe وcpb2 که به ترتیب مربوط به کلستریدیوم پرفرنجنس انتروتوکسین و بتا2 توکسین می باشند، با آزمایش multiplex pcr. 4- تعیین حضور یا عدم حضورژن netb در بین جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده از گله های بیمار و سالم بوسیله آزمایش single pcr. تعیین حضور یا عدم حضورژن tpel در بین جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده از گله های بیمار و سالم بوسیله آزمایش single pcr 5- مقایسه ی گله های سالم و درگیر با بیماری آنتریت نکروتیک از نظر مثبت یا منفی بودن در مورد وجود یا عدم وجود این توکسین ها. برای جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس از لاشه مرغ های مبتلا به آنتریت نکروتیک مراجعه داده شده به بخش طیور کلینیک دانشکده دامپزشکی ، بعد از کالبدگشائی و مشاهده جراحات تیپیک ، قسمتی از روده را که بیشتر درگیر است انتخاب نموده، ابتدا و انتهای قسمت مورد نظر را با نخ تمیز محکم گره زده و روده را از دو طرف گره ها قیچی می کردیم. سپس قطعه مورد نظر را به داخل آزمایشگاه منتقل ودر زیر هود و در مجاورت شعله عملیات مربوط به جداسازی باکتری را ادامه می دادیم. ا بتدا سطح سروزی روده لاشه های مبتلا تو سط تیغه اسپاتول داغ استریل می گردید . سپس موضع بوسیله بیستوری استریل برش داده می شد و توسط یک لوپ استریل مخاط روده تخریش و پس از تهیه گسترش میکروبی و انجام رنگ آمیزی گرم زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گرفت. شناسائی باکتری بر اساس روش های تشریح شده توسط سومانن و همکاران ( 1993 )، کوئین و همکاران ( 1994 ) و میلر وهمکاران ( 1998 ) صورت پذیرفت . در صورت مشاهده باسیل های گرم مثبت حاوی اسپور، تشخیص احتمالی اولیه بر مبنای کلستریدیوم پرفرینجنس قرارمی گرفت. برای جداسازی کلنی کلستریدیوم پرفرینجنس از نمونه هائی که در رنگ آمیزی گرم مثبت بودند بر روی پلیت آ گار خوندارحاوی7% خون دفیبرینه گوسفند کشت خطی داده می شد. سپس پلیت ها کشت داده شده در داخل جار بیهوازی (anaerobic jar, merck, germany ) بصورت وارونه قرار داده شدند. سپس گازپک a (anaerocult a, merck) در داخل جار بی هوازی قرارداده می شد و پس از ریختن 35 سی سی آ ب مقطر بر روی سطح گازپک برای شروع واکنش جذب اکسیژن، بلافاصله درب جار بی هوازی بسته و این جارها در انکوباتور به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شدند. برای تائید شرائط بیهوازی از استریپ های اندیکاتور در هر جار استفاده می گردید . (anaerotest, merck) بعد از این مدت درب جار را در زیر هود و کنار شعله باز و پلیت ها را مشاهده می کردیم. از کلونی های بزرگ صاف و گرد با قطر 2 تا 4 میلیمتر که ایجاد همولیز دو گانه (همولیز کامل در ناحیه داخلی و همولیز ناقص در ناحیه بیر ونی ) کرده بودند، جهت رنگ آمیزی گرم نمونه بر می داریم. باسیل های گرم مثبتی که در شرایط بیهوازی در آگار خوندار همولیز دو گانه ایجاد می کردند به عنوان باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس مشخص می گردیدند . برای تائید تشخیص اولیه وهمچنین جداسازی کلنی خالص کلستریدیوم پرفرینجنس (در صورت خالص نبودن کشت اولیه) از نمونه هائی که بر روی پلیت آ گار خوندار همولیز دو گانه ایجاد کرده و در رنگ آمیزی گرم، باسیل گرم مثبت بودند بر روی محیط های اختصاصی رشد کلستریدیوم پرفرنجنس یعنیtsc یا tsn آگار کشت داده می شدند. بعد از کشت خطی بر روی پلیت های حاوی این محیط ها ، کلنی هائی با هسته مرکزی تیره رنگ مشاهده میشوند که بیانگر حضور باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس می باشد. از کلونی های ذکرشده گسترش تهیه کرده و بس از رنگ آمیزی و مشاهده در زیر میکروسکوپ، اگر باسیل های گرم مثبت تیپیک کلستریدیوم پرفرنجنس به صورت خالص مشخص گشتند و نیازی به کشت مجدد نداشتند، برای نگهداری باکتری در 70- ، یک تک کلونی تیپیک در یک محیط براث مانند bhi به صورت بیهوازی کشت داده می شد و در 37 درجه به مدت24 ساعت انکوبه می گردید و پس از آن از محیط براث حاوی باکتری برداشت نموده و پس از ترکیب با گلیسرین در میکروتیوپ های مخصوص جهت نگهداری در فریزر 70- ، استفاده می شد. استخراج dna به روش boiling کریوتیوپ های جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنسی که درفریزر 70 - نگهداری می شوند را خارج کرده، ابتدا برای چند ساعتی در فریزر 20- قرار داده وسپس در محیط آزمایشگاه قرارمیدادیم تا شوک ناشی از اختلاف دمای فریزر 70 – و محیط باعث از بین رفتن باکتری نشود. یک قطره از نمونه هایی که در محیط bhi به همراه گلیسرول در کریوتیوپ نگهداری می شوند در زیر هود لامینارو کنار شعله با آنس برداشت نموده و در محیط بلاد آگار یا tsn در شرایط بی هوازی کشت می دادیم. بعد از 24 ساعت یک تک کلونی تیپیک از باکتری را با آنس برداشت نموده و در 1 سی سی سرم فیزیولوژی موجود در میکروتیوپ 1.5 سی سی که از نوع dna &rna free بود کاملا حل کرده تا محلول کدری حاصل شود. برای بهتر حل شدن چند ثانیه مخلوط را ورتکس می کردیم. سپس با دور xg3000، 1 تا 5 دقیقه سانتریفیوژ کرده، باکتری ته میکروتیوپ جمع شده و مواد دیگر مثل آگار بالا می ماندند. محول رویی را خالی کرده دوباره 1 سی سی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرده و عمل شستشو را تکرار میکردیم تا موادی که ممکن است همراه باکتری برداشت کرده باشیم را حتی الامکان خارج نماییم. بعد از این که عمل شستشو را 2-3 بار تکرار کردیم و تخلیه نهایی محلول رویی ، 200 سی سی آب مقطر 2 بار تقطیر استریل اضافه میکردیم .دیواره باکتری ترکیده می شد.در این جا نیز مخلوط را خوب ورتکس می کردیم. سپس میکروتیوپ ها را در بن ماری یا حمام 100 درجه به مدت 20 دقیقه قرار میدادیم. در اینجا بهتر است بر روی درب میکروتیوپ ها به منظور پیشگیری از باز شدن در حین جوش در اثر فشاربخار با سوزن استریل سوراخ کوچکی ایجاد بنمائیم. بعد از جوشیدن بلافاصله میکرتیوپ ها را در فریزر 20- قرار می دادیم تا یک شوک حرارتی حاصل شود. سپس 10 دقیقه در دورxg 10000 سانتریفیوژ میکردیم، dna استخراج شده در بالای محلول قرار می گیرفت و پلیتی از مواد زاید در ته میکروتیوپ تشکیل می شد. محلول رویی را به آرامی با سمپلر برداشت کرده به طوریکه به پلیت تشکیل شده برخوردی نکند و در یک میکروتیوپ 0.5 سی سی dna &rna free نگهداری می کردیم تا در واکنش pcr از آن استفاده نماییم.